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CRISPR/Cas系統(tǒng)在感染性疾病診斷中的應(yīng)用

 

圖1 CRISPR/Cas系統(tǒng)用于檢測(cè)原理示意圖
 

此外,沒(méi)有切割活性的cas9(dCas9)仍然有識(shí)別結(jié)合靶序列的能力,這一特點(diǎn)也可以被巧妙利用于生物傳感,例如將兩個(gè)dCas9分別連接上分離熒光素酶的N端和C端,這兩個(gè)dCas9的sgRNA被設(shè)計(jì)為識(shí)別結(jié)核分枝桿菌DNA上下游的序列片段。如果目標(biāo)DNA存在,一對(duì)dCas9在目標(biāo)序列上下游分別結(jié)合,熒光素酶得以重組,發(fā)出熒光信號(hào)用于檢測(cè)(圖1B)[9]。Guk等[10]在2017年報(bào)道了一種利用dCas9對(duì)靶標(biāo)的高度親和性檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌mecA基因的方法,給dCas9蛋白連接磁球,當(dāng)dCas9捕捉結(jié)合靶標(biāo)后,磁性分離出dCas9并用SYBR-GreenⅠ顯色其結(jié)合的雙鏈DNA,這種將CRISPR/Cas9與DNA熒光原位雜交聯(lián)用的方法簡(jiǎn)單快速,并展現(xiàn)出相當(dāng)好的靈敏度。

2.基于CRISPR/Cas13的感染性疾病核酸檢測(cè)平臺(tái):Ⅵ型CRISPR系統(tǒng)包含一個(gè)名為Cas13a的“效應(yīng)器”蛋白,其識(shí)別靶標(biāo)類(lèi)型是單鏈RNA而非DNA(圖1C)。張鋒團(tuán)隊(duì)利用其附屬切割的特點(diǎn)建立起的第一個(gè)檢測(cè)平臺(tái)稱為SHERLOCK[6]。在這個(gè)平臺(tái)中,首先對(duì)靶標(biāo)進(jìn)行重組酶聚合酶擴(kuò)增(recombinase polymerase amplification, RPA)或逆轉(zhuǎn)錄重組酶聚合酶擴(kuò)增(reverse transcription-recombinase polymerase amplification, RT-RPA),然后再進(jìn)行T7轉(zhuǎn)錄,靶標(biāo)被擴(kuò)增的同時(shí)也使得檢測(cè)的靶標(biāo)類(lèi)型不局限于RNA。他們利用SHERLOCK成功對(duì)大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、結(jié)核分枝桿菌、肺炎克雷伯菌和金黃色葡萄球菌進(jìn)行了鑒定,并且區(qū)分出了肺炎克雷伯菌不同的耐藥基因?;赟HERLOCK的檢測(cè)方式檢測(cè)耗時(shí)在2 h內(nèi),并且單次檢測(cè)的成本低廉,為核酸檢測(cè)開(kāi)啟了新篇章。在此基礎(chǔ)上,張鋒課題組還開(kāi)發(fā)出了SHERLOCKv2[11],即SHERLOCK的二代版本,將Cas13a與Csm6(一種輔助的CRISPR Ⅲ型核酸酶)聯(lián)用,兩者協(xié)同作用使得信號(hào)得以增強(qiáng),使檢測(cè)靈敏度較一代提高了3.5倍。通過(guò)用稀釋的等溫?cái)U(kuò)增引物進(jìn)行非飽和反應(yīng),從一代的定性檢測(cè)變?yōu)橄鄬?duì)定量檢測(cè)。通過(guò)應(yīng)用帶有抗FAM抗體和金納米粒子的紙基傳感器,開(kāi)發(fā)出了便攜式試紙條。此外,通過(guò)將篩選出的在附屬切割上有序列偏好的3種Cas13蛋白和1種Cas12a蛋白在一個(gè)體系中應(yīng)用,實(shí)現(xiàn)了一個(gè)體系同時(shí)檢測(cè)4種病原體。這4點(diǎn)性能的提升和突破使得SHERLOCK在感染性疾病檢測(cè)上變得更加靈敏、實(shí)用、便攜和高效,例如在醫(yī)療條件相對(duì)落后地區(qū),不論是DNA、RNA還是細(xì)菌感染導(dǎo)致的肺炎都可以用這種方式進(jìn)行檢測(cè),還可以進(jìn)行人類(lèi)免疫缺陷病毒滴度監(jiān)測(cè)以指導(dǎo)抗病毒治療等。從這些優(yōu)勢(shì)中足以預(yù)見(jiàn)這種新型分子診斷平臺(tái)在感染性疾病診斷上有著極佳的前景。之后,張鋒團(tuán)隊(duì)又將一種通過(guò)加熱和化學(xué)還原的方式裂解病毒顆粒和滅活核糖核酸酶的樣本預(yù)處理方法(HUDSON)添加到SHERLOCK樣本處理步驟中,使得SHERLOCK可以直接用于從臨床樣本中檢測(cè)病毒核酸,而省去提取和純化的樣本預(yù)處理步驟[12]。這進(jìn)一步縮短了樣本周轉(zhuǎn)時(shí)間,簡(jiǎn)化了步驟,這對(duì)于將CRISPR/Cas用于病原體的實(shí)時(shí)快速檢驗(yàn)有非常重要的意義。

3.基于CRISPR/Cas12的感染性疾病核酸檢測(cè)平臺(tái):Ⅱ類(lèi)V-A型Cas12蛋白也被發(fā)現(xiàn)具有反式切割活性,但與Cas13不同,Cas12靶向DNA并附屬切割單鏈DNA(圖1D)。利用Cas12首先開(kāi)發(fā)出的平臺(tái)包括HOLMES和DETECTR。Li等[5]用HOLMES檢測(cè)DNA/RNA病毒,可在1 h內(nèi)從細(xì)胞系或臨床樣本中檢測(cè)病毒基因型和人類(lèi)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP),并且靈敏度也可達(dá)到阿摩爾級(jí)。之后的HOLMESv2利用Cas12b具有很寬的反式切割活性溫度范圍特點(diǎn),將其與環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增方式相結(jié)合,實(shí)現(xiàn)了一個(gè)集靶標(biāo)擴(kuò)增和信號(hào)轉(zhuǎn)化的“一鍋式”核酸檢測(cè)系統(tǒng),支持定量檢測(cè)靶DNA[13]。這是迄今為止用于RNA檢測(cè)的最簡(jiǎn)單的CRISPR生物傳感平臺(tái)。Chen等[14]利用DETECTR快速準(zhǔn)確地鑒定了各種亞型的HPV病毒。與SHERLOCK類(lèi)似的是,HOLMES或是DETECTR都可以通過(guò)剪切熒光報(bào)告探針實(shí)現(xiàn)熒光信號(hào)檢測(cè)或結(jié)合紙基傳感策略實(shí)現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的試紙條檢測(cè)(圖1E)。

      2019年,James課題組提出了一種對(duì)傳統(tǒng)材料進(jìn)行分子編程后用于生物傳感的策略。他們將Cas12a-gRNA復(fù)合物嵌入連有單鏈DNA的晶格結(jié)構(gòu)中制成水凝膠[15]。當(dāng)水凝膠系統(tǒng)暴露于靶標(biāo)DNA存在的環(huán)境中時(shí),Cas12a被激活,其對(duì)周?chē)鷨捂淒NA的反式切割使得水凝膠的骨架被剪切破壞,從而造成水凝膠的塌陷。在生物傳感方面,用此策略檢測(cè)了葡萄球菌的mecA基因片段,激活的Cas12剪切將淬滅熒光基團(tuán)連接于凝膠骨架的單鏈DNA,導(dǎo)致熒光信號(hào)產(chǎn)生。他們還將水凝膠嵌入微流控紙質(zhì)設(shè)備中,開(kāi)發(fā)了一種可以對(duì)埃博拉病毒進(jìn)行實(shí)施快速檢測(cè)的試紙條,這種試紙條在實(shí)戰(zhàn)中表現(xiàn)出相當(dāng)好的靈敏度和可重復(fù)性。新穎的組合方式使得老材料用了新用法,這種創(chuàng)新的思路可以催生更多新穎的生物傳感策略[16]。表1比較了上述具有代表性的基于CRISPR/Cas系統(tǒng)的病原體檢測(cè)分子診斷平臺(tái)的性能。

三、從新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)診斷中看CRISPR/Cas核酸檢測(cè)平臺(tái)的優(yōu)勢(shì)
       2019年底,COVID-19疫情開(kāi)始在全球范圍內(nèi)的多個(gè)國(guó)家暴發(fā),這場(chǎng)疫情也為開(kāi)發(fā)出的基于CRISPR/Cas的分子診斷平臺(tái)提供了實(shí)戰(zhàn)檢驗(yàn)的機(jī)會(huì)。傳統(tǒng)的基于RT-PCR的方法可在4~6 h內(nèi)檢測(cè)病毒,結(jié)果相對(duì)可靠,然而在面臨傳染性高、突變率高的感染性疾病時(shí),局限性也更加凸顯,其準(zhǔn)確性和效率取決于樣本采集部位是否有足夠數(shù)量的病毒基因片段,采集的方法不對(duì)或者錯(cuò)過(guò)采集的窗口時(shí)間可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果,這在大流行階段是非常可怕的[17]。因此為了提高準(zhǔn)確度必須反復(fù)檢測(cè),這會(huì)大大增加時(shí)間及其他附加成本。基于CRISPR/Cas的分子診斷平臺(tái)則在一定程度上彌補(bǔ)了這些缺陷。
Chiu課題組將DETECTR開(kāi)發(fā)用于2019-nCoV檢測(cè),將病毒編碼包膜蛋白和核衣殼的基因作為檢測(cè)的靶點(diǎn)。整個(gè)過(guò)程包括:在62 ℃下進(jìn)行20~30 min的RT-LAMP和在37 ℃下進(jìn)行10 min的Cas12檢測(cè)反應(yīng),總用時(shí)大約30~40 min,并且是在試紙條上讀取結(jié)果。包括RNA提取的整個(gè)過(guò)程大約45 min,檢測(cè)限低至10拷貝數(shù)/μl,其準(zhǔn)確度則與RT-PCR方法不相上下。更重要的是從病原體發(fā)現(xiàn)到開(kāi)發(fā)出這樣成熟的檢測(cè)平臺(tái)也只需要2周左右[18]。
而張鋒團(tuán)隊(duì)則公布了使用SHERLOCK平臺(tái)檢測(cè)2019-nCoV的標(biāo)準(zhǔn)流程。他們選用S基因和Orf1ab基因兩種2019-nCoV特異性序列作為檢測(cè)靶點(diǎn),整個(gè)檢測(cè)過(guò)程包括核酸抽提擴(kuò)增、Cas13反應(yīng)以及試紙條檢測(cè),耗時(shí)在1 h以內(nèi),檢測(cè)限同樣低至10拷貝數(shù)/μl。但考慮到上述方法均需要分兩步,核酸擴(kuò)增到Cas反應(yīng)需要轉(zhuǎn)移樣本,增加了污染概率,張鋒和其他團(tuán)隊(duì)合作又開(kāi)發(fā)出了另一種結(jié)合環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和Cas12b的2019-nCoV檢測(cè)方式,命名為“STOP”(SHERLOCK testing in one pot)[19]。和HOLMESv2類(lèi)似,該方法旨在實(shí)現(xiàn)等溫?cái)U(kuò)增步驟和檢測(cè)一步反應(yīng),減少前處理的步驟,簡(jiǎn)化流程,并使得樣本轉(zhuǎn)移更少,降低污染概率,從而進(jìn)一步提升檢測(cè)的準(zhǔn)確度。
      總之,上述3個(gè)檢測(cè)平臺(tái)在2019-nCoV的診斷中均表現(xiàn)出了良好的靈敏度和特異度,并且速度更快、操作更方便、適用范圍更廣、單次檢測(cè)成本低廉,再次證明CRISPR/Cas核酸檢測(cè)平臺(tái)在傳染病診斷中的優(yōu)勢(shì)和前景。

四、CRISPR/Cas系統(tǒng)應(yīng)用于感染性疾病診斷的優(yōu)勢(shì)與局限及未來(lái)研究方向
      CRISPR/Cas系統(tǒng)毫無(wú)疑問(wèn)為感染性疾病的診斷提供了新的方法和契機(jī),總結(jié)來(lái)說(shuō),它具有如下優(yōu)點(diǎn):(1)相較于基于PCR的傳統(tǒng)方法,毫不遜色的靈敏度和特異度。(2)檢測(cè)所需時(shí)間短。(3)簡(jiǎn)單便攜,不依賴昂貴的儀器和嚴(yán)苛的實(shí)驗(yàn)環(huán)境。(4)試劑耐受冷凍干燥,便于儲(chǔ)存和攜帶。(5)標(biāo)本前處理可以非常簡(jiǎn)單。(6)結(jié)果讀取方便,能通過(guò)熒光或者肉眼讀取結(jié)果。這幾大優(yōu)點(diǎn)使得CRISPR檢測(cè)平臺(tái)可以對(duì)病原體核酸分子實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)快速檢測(cè)。
但是,CRISPR技術(shù)也有一些局限。第一,由于樣本中靶標(biāo)的低豐度,大多基于CRISPR的檢測(cè)方式都需要結(jié)合特定的核酸擴(kuò)增策略,盡管大部分是等溫?cái)U(kuò)增,相對(duì)PCR更加簡(jiǎn)單,但這仍然是其向更加便捷、省時(shí)方向發(fā)展的阻礙。第二,CRISPR技術(shù)需要在病原體的基因序列完全清楚的情況下,才能設(shè)計(jì)gRNA開(kāi)發(fā)出特異的核酸檢測(cè)平臺(tái),這一點(diǎn)使得其在不明病原體引起的疾病流行初期能發(fā)揮的作用可能很有限。第三,由于CRISPR系統(tǒng)附屬切割活性具有持續(xù)性和隨意性,使得此檢測(cè)平臺(tái)在完全定量檢測(cè)、細(xì)胞原位檢測(cè)的應(yīng)用上還有待突破。第四,實(shí)現(xiàn)類(lèi)似于SHERLOCKv2一樣更多種病原體的高通量檢測(cè)難度較大。第五,脫靶效應(yīng)的存在可能導(dǎo)致假陰性結(jié)果的產(chǎn)生。
       因此根據(jù)以上幾點(diǎn)也不難推測(cè)未來(lái)CRISPR技術(shù)的兩大研究方向,第一,是新的Cas蛋白的開(kāi)發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來(lái)發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白,不同于Cas12和Cas13,其擅長(zhǎng)識(shí)別單鏈DNA,豐富了CRISPR工具箱[20]。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測(cè)通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。第二是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺(tái)結(jié)合起來(lái),開(kāi)發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略,比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管[21],以及將Cas系統(tǒng)的報(bào)告探針固定于電極上,從而實(shí)現(xiàn)不需要使用信號(hào)擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建[22]。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實(shí)現(xiàn)多樣化的信號(hào)輸出[15]。與微流體技術(shù)結(jié)合開(kāi)發(fā)出的CARMAN技術(shù),可以對(duì)數(shù)十個(gè)樣本,上百種病毒進(jìn)行快速檢測(cè),為解決通量低的問(wèn)題提供了方法等[23]。不斷地將新興的材料與技術(shù)與CRISPR技術(shù)結(jié)合實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ),開(kāi)發(fā)出更實(shí)用新穎的生物傳感策略用于感染性疾病診斷將是未來(lái)一段時(shí)間內(nèi)的研究重點(diǎn)。
      總之,CRISPR/Cas技術(shù)作為新興的分子診斷策略,盡管有其局限,但其準(zhǔn)確、靈敏、快速、廉價(jià)、便攜的特點(diǎn)已經(jīng)為核酸檢測(cè)帶來(lái)革命性變化,尤其在感染性疾病的檢驗(yàn)診斷上有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì),未來(lái)應(yīng)用前景極佳。

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