猴痘病毒，這個天花病毒的神秘近親，正在全球范圍內(nèi)肆虐。 迄今已有近8萬人淪陷于其威脅之下。為了及時上報疑似病例并掌握疫情的動態(tài)，快速而精確地檢測猴痘病毒成為每個衛(wèi)生部門的當務(wù)之急。
2022年9月，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所研究員Nicolas Berthet、王頌基等在 Viruses 上發(fā)表了一篇題為“Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus”的研究，他們成功研發(fā)出三種可以在20至30分鐘內(nèi)快速、簡便、直觀地診斷猴痘病毒的方法。這些方法不僅與現(xiàn)行的qPCR核酸檢測方法結(jié)果高度一致，而且更加迅速、直接。猴痘是一種臨床癥狀與天花相似，但相對較溫和的疾病，其致死率約為1%—10%。雖然歷史上主要在中非與西非流行，但近些年來，猴痘病毒正日益成為全球關(guān)注的焦點，促使人們深入研究它。MPXV核酸檢測對于監(jiān)測和診斷工作至關(guān)重要，有助于通過積極識別感染病例來減少病毒傳播。目前，用于診斷猴痘的方法主要包括病毒分離、電子顯微鏡和聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction, PCR）等。MPXV檢測的黃金標準是real-time PCR，因為它具有高靈敏度和特異性。然而，由于設(shè)備和技術(shù)限制，該方法在一些MPXV流行的資源匱乏地區(qū)并不總是可行的。因此，簡單的現(xiàn)場檢測對于快速、方便地診斷MPXV感染至關(guān)重要。
圖1. 實時 RPA 和 RPA-Cas12a 檢測系統(tǒng)的靈敏度
本研究中所報道的檢測方法是基于重組聚合酶對病毒基因組的目標區(qū)域進行等溫擴增，并分別與CRISPR/Cas12、核酸外切酶以及橫向流動試紙條相結(jié)合而開發(fā)的。研究人員使用三種檢測方法對19份提取自中非臨床樣本的DNA進行檢測驗證，檢測結(jié)果與傳統(tǒng)檢測定量PCR的結(jié)果一致。
此外，這些方法具有特異性，不會與其他正痘病毒（如痘苗病毒）發(fā)生交叉反應(yīng)。這些診斷方法的開發(fā)為MPXV快速檢測提供了新的、便捷的選項，將有助于控制和預(yù)防MPXV的流行。
圖2. RAA-LFS 檢測的靈敏度和特異性
圖3. 使用三種方法在臨床樣本中檢測MPXV，并與real-time PCR 進行比較
利用real-time RPA和RAA-LFS進行MPXV 檢測的結(jié)果與real-time PCR結(jié)果顯示出高度的一致性（100%），RPA-Cas12a則顯示出83.3%的一致性。在低濃度核酸擴增過程中，將少量擴增產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到新管中時，可能會出現(xiàn)局部快速擴增，造成進樣誤差，導(dǎo)致檢測靈敏度降低。因此在未來的研究中，有必要將RPA-Cas12a方法進一步優(yōu)化為單管檢測，以提高靈敏度。
基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴增的等溫擴增測定技術(shù)（Isothermal Amplification Assays based on Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP）此前已用于MPXV檢測開發(fā)。盡管該檢測也不需要特定的實驗室設(shè)備，但與nested PCR 的結(jié)果相比，該檢測僅具有72%的一致性，且需要大約60分鐘才能生成結(jié)果。此外，LAMP MPXV 檢測需要六對引物，但三種基于重組酶的擴增檢測只需要一對引物和一個探針，從而簡化了診斷設(shè)計。之前發(fā)表的針對 G2R 基因的 MPXV-RPA 檢測結(jié)果與我們的real-time RPA 結(jié)果一致，但需要專門的儀器和訓(xùn)練有素的實驗室工作人員，這限制了其在非專業(yè)人士家庭使用的實用性。
相比之下，RAA-LFS 更加用戶友好，因為其操作簡單，并且與其他基于試紙的檢測（例如 pH 或妊娠測試）相似，這使得在家自我檢測更加可行。
總的來說，這項研究成功地將RPA/RAA技術(shù)與CRISPR-Cas系統(tǒng)相結(jié)合，開創(chuàng)了一個快速、準確、方便的猴痘病毒檢測平臺。這不僅為當前的疫情檢測提供了強有力的支持，更為未來的防控工作打下了堅實的基石。
原文鏈接：https://www.mdpi.com/1999-4915/14/10/2112
參考文獻：Mao L, Ying J, Selekon B, Gonofio E, Wang X, Nakoune E, Wong G, Berthet N. Development and Characterization of Recombinase-Based Isothermal Amplification Assays (RPA/RAA) for the Rapid Detection of Monkeypox Virus. Viruses. 2022 Sep 23;14(10):2112. doi: 10.3390/v14102112. PMID: 36298667; PMCID: PMC9611073.
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