亚洲视频高清不卡在线观看,日本高清不卡一区二区三,AV无码专区在线播放蜜桃,91日韩欧美综合

近年來，以CRISPR/Cas為代表的基因編輯帶來了生物技術(shù)革命性的進(jìn)步，分別在2015和2017年兩次被Science評(píng)為年度突破性科學(xué)進(jìn)展之首，獲評(píng)Nature近10年最具影響力的五大科學(xué)事件之首和2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。短短幾年時(shí)間，CRISPR技術(shù)成為科研界的熱門內(nèi)容，被稱為下一代分子診斷技術(shù)！

CRISPR/Cas系統(tǒng)介紹:

     1987年，CRISPR 位點(diǎn)在細(xì)菌基因組中被發(fā)現(xiàn)，2002年CRISPR相關(guān)蛋白被發(fā)現(xiàn)，隨后證實(shí)CRISPR-Cas系統(tǒng)是一種RNA引導(dǎo)的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，可以抵御病毒、質(zhì)粒等入侵遺傳元素，其免疫過程大致可以分為三個(gè)階段：適應(yīng)、表達(dá)和干擾。

（1）適應(yīng)階段Cas蛋白識(shí)別并捕獲外來核酸片段，獲取新間隔序列，并整合插入自身CRISPR陣列，形成免疫記憶。

（2）表達(dá)階段當(dāng)外來核酸再次入侵時(shí)，從CRISPR陣列中相對(duì)應(yīng)的間隔序列，轉(zhuǎn)錄出CRISPRRNA（crRNA）前體并加工獲得小的、成熟的crRNA，其中包含一個(gè)保守的重復(fù)序列和一個(gè)間隔序列，crRNA進(jìn)一步與一個(gè)或多個(gè)Cas蛋白相互作用，形成RN（ribonucleoprotein）復(fù)合體。

（3）干擾階段Cas-crRNA復(fù)合體識(shí)別外來核酸，通過crRNA靶向目標(biāo)核酸區(qū)域，介導(dǎo)Cas蛋白特異性地破壞入侵核酸。

CRISPR/Cas可分為二大類群：第1類以多個(gè)Cas組成的效應(yīng)復(fù)合體行使功能為特征，包括Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ型；第2類則只需單個(gè)多結(jié)構(gòu)域的Cas，包括Ⅱ（Cas9）、Ⅴ（Cas12）和Ⅵ（Cas13）型。第2類系統(tǒng)簡單、高效、操作方便，是目前主要的基因編輯系統(tǒng)，其中最具代表性的是Cas9。

                                                                                 Cas9編輯基因原理

     相比Cas9，Cas12a和Cas13a僅需crRNA 即可實(shí)現(xiàn)特異性靶位點(diǎn)切割，這表明其系統(tǒng)更為簡潔，具有成為精度更高、安全性更好的新一代基因編輯工具的潛力。

基于Cas12a的分子檢測系統(tǒng):

      廣泛應(yīng)用于核酸檢測的三種Cas12a蛋白包括LbCas12a、AsCas12a和FnCas12a，其中LbCas12a的反式切割活性最強(qiáng)。2017年Jennifer Doudna團(tuán)隊(duì)開發(fā)了DETECTR（DNA endonuclease-targeted CRISPR trans reporter）檢測技術(shù)，利用LbCas12a（Lachnospiraceae bacterium ND2006）與crRNA復(fù)合物，并在crRNA引導(dǎo)下利用RuvC結(jié)構(gòu)域切割PAM（TTTN）序列下游18~25nt的靶DNA，在識(shí)別并切割靶標(biāo)dsDNA的同時(shí)，激發(fā)Cas12a的反式切割活性，切割反應(yīng)體系中的ssDNA報(bào)告分子。ssDNA報(bào)告分子標(biāo)記有熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)，一旦切割，熒光基團(tuán)和猝滅基團(tuán)被分離，就會(huì)產(chǎn)生穩(wěn)定而強(qiáng)烈的熒光信號(hào)，熒光信號(hào)的強(qiáng)度可以指示檢 測樣本中靶標(biāo)的量。此外，DETECTR還與重組酶聚合酶等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)結(jié)合（recombinase polymerase amplification，RPA），不僅提高了檢測分析的靈敏度（amol/L水平），而且避免了對(duì)復(fù)雜、昂貴設(shè)備的需求。該技術(shù)現(xiàn)已成功應(yīng)用于人乳頭狀瘤病毒（human papilloma virus，HPV）和SARS-CoV-2的檢測。

                          DETECTR檢測方法原理圖

2018年王金、趙國屏團(tuán)隊(duì)建立了HOLMES（one-hour lowcost multipurpose highly efficient system）檢測技術(shù)，聯(lián)合LbCas12a與PCR擴(kuò)增，可以在1 h內(nèi)完成對(duì)偽狂犬病毒（pseudorabies virus，PRV）和日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）的檢測，靈敏度可以達(dá)到1～10 amol/L，此外還可以準(zhǔn)確區(qū)分病毒基因型以及人類的單核苷酸多態(tài)性 。但是，該技術(shù)聯(lián)合PCR擴(kuò)增提高穩(wěn)定性的同時(shí)也增加了檢測時(shí)間和設(shè)備依賴性。

基于Cas12b的分子檢測系統(tǒng):

    來源于嗜熱菌的Cas12b含有單個(gè)RuvC結(jié)構(gòu)域，脫靶效應(yīng)低且同樣具有反式切割活性。CRISPRCas12b是雙RNA引導(dǎo)的DNA核酸內(nèi)切酶系統(tǒng)，可以識(shí)別和切割靶向dsDNA或ssDNA，也可以非特異性切割ssDNA。當(dāng)靶向dsDNA時(shí)，Cas12b依靠PAM序列（TTC或TAC）完成順式切割。當(dāng)靶向ssDNA時(shí)，Cas12b可不依賴PAM序列實(shí)現(xiàn)切割，而且切割活性高于dsDNA。

    根據(jù)這些特性，王金、趙國屏團(tuán)隊(duì)建立了升級(jí)版的HOLMESv2，將AacCas12b（Alicyclobacillus acidoterrestris）蛋白與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loopmediated isothermal amplification，LAMP）結(jié)合，只有含有5?-TTC-3?的dsDNA或切割后具有的5?-TAC-3?的DNA序列才能激活A(yù)acCas12b反式切割活性，該技術(shù)實(shí)現(xiàn)了DNA、RNA特異性檢測以及區(qū)分SNP和定量DNA甲基化。

   2019年，Dai等開發(fā)了基于CRISPR-Cas12a的E-CRISPR檢測技術(shù)，通過CRISPR-Cas系統(tǒng)來影響電信號(hào)輸出，利用Cas12a的反式切割活性獲得高傳導(dǎo)信號(hào)。該檢測技術(shù)將修飾有3′-亞甲基藍(lán)（3′-MB）標(biāo)簽的ssDNA報(bào)告分子固定于金電極上，在靶DNA存在的情況下，Cas12a-crRNA反式切割MB-ssDNA分子，亞甲基藍(lán)標(biāo)簽的分離，會(huì)使電化學(xué)信號(hào)降低。在沒有靶標(biāo)DNA存在時(shí)，Cas12a的反式切割活性保持沉默，ssDNA分子保留在電極表面，從而導(dǎo)致亞甲基藍(lán)的高電化學(xué)電流。

                                                                     SHERLOCK檢測方法原理

    2020年，Ding等開發(fā)了AIOD CRISPR（all-in-one dual CRISPR-Cas12a）檢測技術(shù)，將RPA擴(kuò)增和CRISPR檢測的所有反應(yīng)組分混合，在引入兩個(gè)crRNA的同時(shí)，添加高濃度ssDNA報(bào)告分子，一步即可完成對(duì)SARS-CoV-2和HIV-1的檢測。

基于Cas13的分子檢測系統(tǒng)：

    Cas13是RNA引導(dǎo)和RNA靶向的核酸酶，具有兩個(gè)HEPN結(jié)構(gòu)域，特異性作用于RNA靶標(biāo)。2017年，張峰團(tuán)隊(duì)開發(fā)了SHERLOCK（specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking）核酸檢測技術(shù)。該技術(shù)與DETECTR原理相同，但依賴于LwaCas13a（Leptotirichia wadei）核酸酶的活性，識(shí)別和切割靶標(biāo)RNA的同時(shí)，反式切割ssDNA報(bào)告分子產(chǎn)生熒光信號(hào)。

                                                                             SHERLOCK檢測方法原理

   為了解決定量的問題，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了SHERLOCKv2，將4種類型的Cas蛋白（LwaCas13a、PsmCas13b、CcaCas13b和AsCas12a）組合使用，切割用不同的熒光基團(tuán)標(biāo)記的報(bào)告分子，在FAM、Cy5、HEX和TEX通道中進(jìn)行檢測，實(shí)現(xiàn)了定量同時(shí)檢測4種核酸序列。SHERLOCKv2也被應(yīng)用于側(cè)向流動(dòng)分析，通過金納米顆粒標(biāo)記的抗FAM抗體，在試紙條上檢測被切割的報(bào)告分子，產(chǎn)生視覺比色信號(hào)。

                                            SHERLOCKv2 檢測結(jié)果讀取方式

    2020年，ACKERMAN等聯(lián)合CRISPR診斷和微流控技術(shù)開發(fā)了CARMEN（combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids）檢測平臺(tái)，該技術(shù)可以同時(shí)檢測8個(gè)樣本，169種人類相關(guān)病毒。但由于芯片定制成本高和檢驗(yàn)操作流程復(fù)制，很難應(yīng)用于臨床。該團(tuán)隊(duì)在CARMENv.1的基礎(chǔ)上開發(fā)了mCARMEN（microfluidic combinatorial arrayed reactions for multiplexed evaluation of nucleic acids），將CRISPR診斷、微陣列技術(shù)與簡化的臨床工作流程相結(jié)合，開發(fā)的mCARMEN呼吸道病毒檢測面板，可同時(shí)檢測21種呼吸道病毒，包括SARS-CoV-2及其他冠狀病毒、流感病毒等。

                                 CARMEN-Cas13檢測方法原理

    Arizti-Sanz團(tuán)隊(duì)將擴(kuò)增與CRISPR-Cas13系統(tǒng)檢測整合為一步診斷平臺(tái)SHIN（streamlined highlight of infection to navigate pandemic），通過添加RNase H提高核酸檢測靈敏度，并采用管內(nèi)熒光和配套的智能手機(jī)應(yīng)用程序，實(shí)現(xiàn)了SARS-CoV-2有效的核酸檢測。SHINE診斷平臺(tái)最大限度地減少了對(duì)設(shè)備的要求，也減少了結(jié)果讀數(shù)偏差。

基于Cas14的分子檢測系統(tǒng)：

    除了Cas12和Cas13系統(tǒng)外，結(jié)構(gòu)緊湊的Cas14蛋白也具有類似的反式切割活性。Cas14是一種靶向ssDNA的CRISPR內(nèi)切酶，與CRISPRCas12相比，Cas14識(shí)別和切割目標(biāo)核酸序列不受PAM序列的限制，而且對(duì)crRNA與靶標(biāo)模板之間的核苷酸錯(cuò)配的容忍性更低，內(nèi)部序列對(duì)核苷酸錯(cuò)配更敏感，這一特性使Cas14能夠?qū)崿F(xiàn)高保真的區(qū)分SNP?；诖颂匦越⒌腃as14a-DETECTR檢測平臺(tái)，已應(yīng)用于人類HERC2基因SNP分型。

                                                                   CRISPR/Cas14a分子檢測示意圖

CRISPR/Cas技術(shù)優(yōu)勢:

發(fā)展至目前，基于CRISPR的核酸檢測技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：

(1)高特異性，可實(shí)現(xiàn)單核苷酸點(diǎn)突變檢測；

(2)高靈敏性，可實(shí)現(xiàn)單拷貝核酸檢測；

(3)快速性，整個(gè)檢測在0.5–1.0h內(nèi)完成；

(4)簡便性，不需專業(yè)設(shè)備及人員，可現(xiàn)場完成；

(5)試劑耐受冷凍干燥，便于儲(chǔ)存和攜帶；

(6)易開發(fā)性，可快速開發(fā)出新核酸檢測試劑盒等。

      隨著進(jìn)一步的改進(jìn)和優(yōu)化，其更具通用性，CRISPR核酸檢測技術(shù)將成為POCT的最優(yōu)選。

已報(bào)道的多種基于 CRISPR 的分子檢測技術(shù)比較

CRISPR/Cas未來方向

    第一，是新的Cas蛋白的開發(fā)及突變體的篩選鑒定。例如后來發(fā)現(xiàn)的Cas14蛋白，不同于Cas12和Cas13，其擅長識(shí)別單鏈DNA，豐富了CRISPR工具箱。而具有不同切割特性的Cas蛋白的篩選鑒定為提高檢測通量及降低“脫靶效應(yīng)”提供了方法。

    第二，是將CRISPR/Cas其和其他的技術(shù)平臺(tái)結(jié)合起來，開發(fā)新穎實(shí)用的生物傳感策略。比如將Cas9蛋白固定于石墨烯場效應(yīng)晶體管，以及將Cas系統(tǒng)的報(bào)告探針固定于電極上，從而實(shí)現(xiàn)不需要使用信號(hào)擴(kuò)增的電化學(xué)生物傳感器的構(gòu)建。使用水凝膠作為其響應(yīng)原件實(shí)現(xiàn)多樣化的信號(hào)輸出。與微流體技術(shù)結(jié)合開發(fā)出的CARMAN技術(shù)，可以對(duì)數(shù)十個(gè)樣本，上百種病毒進(jìn)行快速檢測，為解決通量低的問題提供了方法等。

RPA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列