DNA甲基化檢測（重亞硫酸鹽處理）試劑盒
DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳學(xué)修飾，在基因表達調(diào)控、發(fā)育調(diào)節(jié)、基因組印跡等方面發(fā)揮重要作用。在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化下，CpG雙核苷的胞嘧啶第5 位碳原子被選擇性地添加甲基基團。 在人類腫瘤中，普遍發(fā)生甲基化異常的現(xiàn)象，由于甲基化與胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)，因此DNA甲基化狀態(tài)的變化可作為疾病診斷和預(yù)后的一個有用的指示器。
最早在1970年，重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化就被用于鑒別DNA中的胞嘧啶和5-甲基胞嘧啶（5-mC）?，F(xiàn)在認(rèn)為在重亞硫酸鹽處理過程中，5-甲基胞嘧啶（5-mC）和5-羥甲基胞嘧啶（5-hmC）都不會發(fā)生堿基的變化，因此這種方法不能用來區(qū)別不同的甲基化修飾。在重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化過程中，DNA首先用重亞硫酸鈉處理，在高溫和低pH條件下，將變性DNA（單鏈DNA）中的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為胞嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物，這個反應(yīng)是可逆的；接下來胞嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物發(fā)生不可逆的水解脫氨基過程，形成尿嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物。最后在高pH條件下尿嘧啶-重亞硫酸鹽衍生物脫磺酸基形成尿嘧啶。只有未甲基化的胞嘧啶在重亞硫酸鹽處理下發(fā)生堿基變化， 5-mC和5-hmC仍然保持不變。轉(zhuǎn)化處理后的DNA經(jīng)PCR擴增，尿嘧啶（U）轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵汆奏ぃ?span>T
圖1 重亞硫酸鹽處理將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶
Active motif公司的Bisulfite
Conversion Kit提供優(yōu)化的轉(zhuǎn)化試劑、簡單易用的操作步驟以及陽性對照PCR引物，簡化了DNA甲基化檢測的過程。整個轉(zhuǎn)化可在1.5小時之內(nèi)完成，轉(zhuǎn)化效率高達99%。試劑盒提供轉(zhuǎn)化特異性PCR引物，可用于測序前驗證重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化效率。陽性對照PCR引物適用于重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理的人和小鼠DNA，經(jīng)PCR擴增可得到220 bp的產(chǎn)物。
Active motif同時也提供MethylDetector?重亞硫酸鹽修飾試劑盒，該試劑盒是Active motif公司最初提供的一款DNA甲基化檢測試劑盒，原理和Bisulfite Conversion Kit一樣，但轉(zhuǎn)化時間需要5小時。
圖2 Bisulfite Conversion Kit 操作流程
使用Bisulfite Conversion Kit，將目的DNA用蛋白酶K處理，加入重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑和DNA變性劑，在溫度循環(huán)儀中進行快速熱變性。經(jīng)過1.5小時的DNA轉(zhuǎn)化反應(yīng)，樣品加入到試劑盒里的DNA純化柱，脫鹽后洗脫DNA，可用于PCR或其他的下游實驗。
圖3 陽性對照轉(zhuǎn)化特異性PCR引物可用于特異性擴增轉(zhuǎn)化后的人和小鼠DNA
使用Bisulfite Conversion Kit處理人（A）和小鼠（B）基因組DNA，處理（Bis）和未處理（Untr）的DNA分別用陽性對照轉(zhuǎn)化特異性PCR引物進行PCR擴增分析。陽性對照PCR引物專門適用于經(jīng)重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化的DNA，因此會擴增出220bp的條帶，而未處理的DNA沒有擴增出相應(yīng)條帶。
供貨商
產(chǎn)品編號
產(chǎn)品名稱
規(guī)格
Active Motif
55016
Bisulfite Conversion Kit
50 rxns
Active Motif
55001
MethylDetector?
50 rxns
Active Motif
55003
Fully Methylated Jurkat DNA
10 μg
Active Motif
55007
Jurkat genomic DNA
10 μg
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