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mRNA（Messenger RNA、信使RNA）是將DNA中的基因信息傳遞到蛋白的中間信使。mRNA疫苗治療（見(jiàn)下圖）是指在體外合成mRNA，將其導(dǎo)入體內(nèi)，mRNA進(jìn)入細(xì)胞后翻譯表達(dá)出抗原蛋白，抗原刺激體內(nèi)免疫系統(tǒng)，激活體液免疫和細(xì)胞免疫，當(dāng)機(jī)體再次接觸同種抗原（細(xì)胞/病毒），可產(chǎn)生快速免疫應(yīng)答反應(yīng)，自我保護(hù)。
mRNA疫苗具有研發(fā)速度快、靈活、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單、平臺(tái)化、容易擴(kuò)充產(chǎn)能，可以用于精準(zhǔn)化和個(gè)性化治療，一次可呈遞多種抗原等優(yōu)點(diǎn)。mRNA疫苗屬于第三代疫苗技術(shù)（見(jiàn)下圖），相比于傳統(tǒng)疫苗需要通過(guò)將病原微生物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)人工滅毒﹑減活﹑基因工程的方法制成的繁雜工序，第三代疫苗特異性更強(qiáng)，有效性更高，并且研發(fā)周期較快。它的結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、可人工批量合成，并且可以在研發(fā)階段進(jìn)行高通量篩選，大大節(jié)省研發(fā)時(shí)間。而且相較于DNA疫苗，mRNA疫苗沒(méi)有導(dǎo)入外源基因的遺傳風(fēng)險(xiǎn)，起效更快，效果更強(qiáng)。
mRNA疫苗相對(duì)于其他疫苗的優(yōu)勢(shì) 圖片引用于網(wǎng)絡(luò)
mRNA疫苗具有工藝通用性好，研發(fā)速度快，能夠活化細(xì)胞免疫，刺激效果好，遞送效果好等特性。高的mRNA產(chǎn)量需要高效的mRNA體外合成方法，大規(guī)模生產(chǎn)選擇T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性，降低免疫原性并提升翻譯效率，最有效的解決方案是：使用加帽酶對(duì)mRNA進(jìn)行加帽，使其在細(xì)胞內(nèi)外穩(wěn)定，降低免疫原性，并且使mRNA可以被核糖體識(shí)別，啟動(dòng)翻譯程序。近岸蛋白質(zhì)提供一系列mRNA體外合成酶及試劑，解決mRNA疫苗的關(guān)鍵痛點(diǎn)。所有產(chǎn)品均采用藥用規(guī)格原輔料生產(chǎn)，嚴(yán)格控制宿主蛋白質(zhì)殘留、核酸殘留及常見(jiàn)病原體污染，符合GMP規(guī)范的產(chǎn)品生產(chǎn)與質(zhì)量管理規(guī)程，保障生產(chǎn)過(guò)程及所有原輔料可追溯。
GMP級(jí)mRNA體外合成及修飾原料，animal-free，ampicillin-free
產(chǎn)品生產(chǎn)、質(zhì)量控制及配套文件體系，符合mRNA疫苗及藥物研發(fā)生產(chǎn)需求
經(jīng)過(guò)臨床使用驗(yàn)證，單批次產(chǎn)能千萬(wàn)人份，年產(chǎn)能50億人份
mRNA疫苗體外合成關(guān)鍵步驟及相關(guān)產(chǎn)品：
1、生成模板-質(zhì)粒線性化 相關(guān)產(chǎn)品：Bsa I，GMP Grade（貨號(hào)：GMP-RE026）
此步將構(gòu)建好的質(zhì)粒酶切，處理成線性化雙鏈DNA模板，用于下一步mRNA合成。
限制性內(nèi)切酶Bsa I 特異性識(shí)別雙鏈DNA中位點(diǎn)并進(jìn)行酶切，可將模板質(zhì)粒酶切線性化，作為mRNA體外合成模板；
酶切位點(diǎn)：
產(chǎn)品特點(diǎn)：
強(qiáng)特異性
受CpG、Dcm甲基化影響，剪切阻斷
受EcoBI甲基化影響，剪切可能受影響
不受Dam甲基化影響
2、mRNA體外合成 相關(guān)產(chǎn)品：T7 RNA Polymerase, GMP Grade (貨號(hào)：GMP-E121)
此步以DNA為模板，在體外由RNA聚合酶催化合成mRNA。
T7 RNA Polymerase（T7 RNA聚合酶）是高度特異識(shí)別T7啟動(dòng)子序列的5'→3' RNA聚合酶，以含有T7啟動(dòng)子序列的單鏈或雙鏈DNA為模板，以NTP為底物，合成與啟動(dòng)子下游的單鏈DNA互補(bǔ)的RNA。T7 RNA聚合酶是體外轉(zhuǎn)錄mRNA的關(guān)鍵酶。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
高度特異識(shí)別T7啟動(dòng)子
20ul反應(yīng)體系，產(chǎn)量可達(dá)150ug
可對(duì)低至1ng模板進(jìn)行有效轉(zhuǎn)錄
合成長(zhǎng)度可達(dá)15k
體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的mRNA，Qsep1結(jié)果顯示，純度高，均一性好。
3、mRNA轉(zhuǎn)錄后修飾：加帽加尾
此步對(duì)mRNA進(jìn)行修飾，合成功能完整的mRNA。
完整mRNA結(jié)構(gòu)
3.1、mRNA加帽(Cap0) 相關(guān)產(chǎn)品：Vaccinia Capping Enzyme, GMP Grade (貨號(hào)：GMP-M062)
此步與3.2同時(shí)進(jìn)行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結(jié)構(gòu)。
在真核生物中，轉(zhuǎn)錄后的mRNA必需經(jīng)過(guò)一系列修飾才能形成完整的結(jié)構(gòu)，即在5'端形成一個(gè)帽子結(jié)構(gòu)（Cap1），3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。
Vaccinia Capping Enzyme（牛痘病毒加帽酶）用于給體外轉(zhuǎn)錄合成的mRNA催化加上帽子結(jié)構(gòu)（Cap0），顯著改善mRNA的穩(wěn)定性和翻譯能力，使mRNA可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)蛋白，避免核酸外切酶等的降解破壞。
mRNA的帽結(jié)構(gòu)是由一個(gè)7-甲基鳥(niǎo)苷通過(guò)一個(gè)5′–5′三磷酸酯橋連接到mRNA 鏈的5′核苷上組成。Cap-0結(jié)構(gòu)由相鄰的RNA鏈通過(guò)三種酶的依次反應(yīng)形成。進(jìn)一步形成cap-1結(jié)構(gòu)需要2-O甲基轉(zhuǎn)移酶（Cat. No: GMP-M072, Novoprotein）參與，該修飾可以降低RNA在體內(nèi)引起的細(xì)胞先天免疫反應(yīng)。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
高效完成mRNA加帽Cap0
提高mRNA的穩(wěn)定性，防止被RNA酶降解
提高mRNA的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量
3.2、mRNA加帽(Cap1) 相關(guān)產(chǎn)品：mRNA 2’-O-Methyltransferase, GMP Grad e (貨號(hào)：GMP-M072)
此步與3.1同時(shí)進(jìn)行，在mRNA的5'端加上Cap0帽結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，再將Cap0轉(zhuǎn)化為Cap1結(jié)構(gòu)。
真核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。已知Cap1結(jié)構(gòu)存在于所有真核生物mRNA，在穩(wěn)定mRNA結(jié)構(gòu)和提高翻譯效率方面起重要作用。研究表明，體外轉(zhuǎn)錄修飾得到的Cap1結(jié)構(gòu)mRNA更不容易被免疫系統(tǒng)的RNA感受器（RIG-I）識(shí)別，因此免疫刺激更低。
mRNA Cap 2′-O-Methyltransferas （2′-O-甲基轉(zhuǎn)移酶）可利用 S-腺苷甲硫氨酸（SAM）作為甲基供體， 在 RNA 5′末端緊鄰帽結(jié)構(gòu)（Cap 0）的第一個(gè)核苷酸的 2′-O 上添加甲基基團(tuán)，形成帶有 Cap 1 結(jié)構(gòu)的 mRNA。Cap1 結(jié)構(gòu)能增強(qiáng) mRNA 的翻譯效率，從而可提高轉(zhuǎn)染后 mRNA 編碼的蛋白表達(dá)水平。該酶只能以帶 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 為底物，不會(huì)作用于 5′末端為pN、ppN、 pppN 或 GpppN 的 RNA。帶 7-甲基鳥(niǎo)苷帽結(jié)構(gòu)（m7GpppN）的 RNA 可通過(guò) Vaccinia Capping System（Cat. No: GMP-M062, Novoprotein）來(lái)制備。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
使mRNA的Cap 0帽子甲基化為 Cap 1帽子
提高 RNA 的翻譯效率，提高蛋白產(chǎn)量
進(jìn)一步降低免疫原性
完整mRNA在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)GFP蛋白，加帽酶與帽類似物對(duì)比
3.3、mRNA加尾(PolyA) 相關(guān)產(chǎn)品：E. coli Poly(A) Polymerase, GMP Grade (貨號(hào)：GMP-M012)
此步在mRNA的3'端加上PolyA尾。
真核生物中，mRNA的轉(zhuǎn)錄后須經(jīng)系列修飾，在5'端形成一個(gè)特殊結(jié)構(gòu)，即帽子結(jié)構(gòu)，3’端形成PolyA尾結(jié)構(gòu)。這些結(jié)構(gòu)與mRNA的穩(wěn)定、轉(zhuǎn)運(yùn)和翻譯密切相關(guān)。Poly A與成熟mRNA的穩(wěn)定性、翻譯起始以及出核運(yùn)輸有關(guān)，體內(nèi)轉(zhuǎn)錄后修飾中，polyA聚合酶在RNA 3’-OH上逐一引入100-200個(gè)A堿基。
體外轉(zhuǎn)錄RNA過(guò)程中，E. coli Poly (A) Polymerase（加尾酶） 不依賴模板的存在，可以催化 ATP 以 AMP 的形式依次摻入到 RNA 的 3′末端，即在 RNA 的 3′末端加多聚 A 尾。Poly (A) 聚合酶具有很高的加尾效率，可以在 RNA 的 3′末端加入 20~200 個(gè) A 堿基。最大程度還原體內(nèi)加尾過(guò)程。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
穩(wěn)定mRNA的存在形式
引導(dǎo)轉(zhuǎn)錄終止
提高RNA在真核細(xì)胞中的翻譯效率
4、其他相關(guān)產(chǎn)品
4.1、防止mRNA降解 相關(guān)產(chǎn)品：RNase inhibitor, GMP Grade (貨號(hào)：GMP-E125)
在流程2-3 mRNA合成與修飾中加入RNase Inhibitor，防止RNA降解。
RNase Inhibitor可與RNase A形成1：1復(fù)合體，對(duì)RNase 有極強(qiáng)非競(jìng)爭(zhēng)性抑制，保護(hù)mRNA轉(zhuǎn)錄后不被降解
產(chǎn)品特點(diǎn)：
強(qiáng)抑制RNase活性
穩(wěn)定性強(qiáng)
4.2、降解模板DNA 相關(guān)產(chǎn)品：DNase I, GMP Grade (貨號(hào)：GMP-E127)
在流程2 RNA合成結(jié)束后，去除模板DNA。
DNase I將單鏈或雙鏈DNA隨機(jī)分解。
DNase I 去除RNA樣本種的DNA殘留
4.3、增加mRNA產(chǎn)量 相關(guān)產(chǎn)品：Pyrophosphatase, Inorganic (yeast), GMP Grade (貨號(hào)：GMP-M036)
在流程2 RNA合成過(guò)程中加入無(wú)機(jī)焦磷酸酶，增加RNA產(chǎn)量。
無(wú)機(jī)焦磷酸酶PPase（Pyrophosphatase, Inorganic）可催化無(wú)機(jī)焦磷酸鹽水解生成正磷酸鹽（P2O7-4+H2O+PPase→2HPO4-2），一方面可去除無(wú)機(jī)焦磷酸鹽對(duì)反應(yīng)體系的抑制，另一方面為反應(yīng)提供熱力學(xué)動(dòng)力，促進(jìn)產(chǎn)物的生成。常用于RNA、DNA、蛋白質(zhì)的生物合成中，是一種良好的輔劑，在mRNA疫苗體外大規(guī)模合成中加入可顯著提高產(chǎn)量。
轉(zhuǎn)載來(lái)源：RNAScript
原文：近岸蛋白質(zhì)網(wǎng)站 Fr. https://www.novoprotein.com.cn/Cn/product/inproducts/id/536/catid/38.html
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