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文章信息
期刊名稱：《Journal of Advanced Research》
文章標(biāo)題：《Development of a novel Cas13a/Cas12a-mediated “one-pot”dual detection assay for genetically modified crops》
影響因子：11.4
研究團(tuán)隊(duì)：浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院汪小福
原文鏈接：http://www.amp-future.com/vip_doc/28586987.html

轉(zhuǎn)基因作物已在世界各地廣泛種植，許多國家逐步完善轉(zhuǎn)基因監(jiān)管措施以確保轉(zhuǎn)基因作物的安全。開發(fā)快速和準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)基因現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)方法對(duì)農(nóng)業(yè)和生物安全非常重要，可以減輕公眾對(duì)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的擔(dān)心。

在本研究中，課題組開發(fā)了一種新的一鍋法反應(yīng)——雙重MIRA檢測(cè)結(jié)合雙重CRISPR（MR-DCA方法），用于同時(shí)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物中的CaMV35S和NOS遺傳靶點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因作物的檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單高效的方法。

Part 01實(shí)驗(yàn)方法

將雙重MIRA產(chǎn)物用雙Cas13a、Cas12a系統(tǒng)進(jìn)行分析，產(chǎn)生兩個(gè)互不干擾的獨(dú)立信號(hào)，再通過照明儀器讀取熒光顏色，或通過帶有兩條T線的試紙條，以實(shí)現(xiàn)雙通道讀出。整個(gè)過程在不到35min的時(shí)間內(nèi)完成，檢測(cè)限低至20個(gè)拷貝。

                                                                    （MR-DCA檢測(cè)CaMV35S和NOS的原理）

整個(gè)實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)步驟：MIRA擴(kuò)增、CRISPR反應(yīng)、2種方式的結(jié)果判讀。

CaMV35S基因作為Cas13a的靶標(biāo)，NOS基因作為Cas12a的靶標(biāo)，分別設(shè)計(jì)了兩對(duì)MIRA引物。Cas13a系統(tǒng)只識(shí)別RNA，因此設(shè)計(jì)了正向引物區(qū)域，包含一個(gè)T7啟動(dòng)子，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄，激活Cas13a。為NOS基因增加一個(gè)PAM 。以上的這些的添加確保了Cas13a和Cas12a蛋白都可以與各自的crRNA結(jié)合，且兩個(gè)系統(tǒng)之間不存在干擾或交叉反應(yīng)。

Part 02實(shí)驗(yàn)情況

靈敏度和特異性

將樣本梯度稀釋來測(cè)試MIRA反應(yīng)的熒光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)樣本濃度在20μL時(shí)仍能檢測(cè)到熒光強(qiáng)度，最終實(shí)驗(yàn)選定20μL的濃度。

                                                                            （不同樣本濃度和熒光強(qiáng)度測(cè)試）

                                                          （不同樣本濃度和試紙條顯色測(cè)試并用強(qiáng)度量化計(jì)算）

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)MR-DCA的特異性，課題組對(duì)非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物混合樣品和非轉(zhuǎn)基因植物混合樣品進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示只有含有CaMV35S和NOS的轉(zhuǎn)基因樣品具有較高的熒光信號(hào)，而其他樣品的熒光強(qiáng)度與陰性對(duì)照比較接近。MR-DCA可作為一種特定的雙靶點(diǎn)核酸檢測(cè)平臺(tái)。

用MR-DCA對(duì)24個(gè)作物樣品進(jìn)行了測(cè)試。其中1、2、15、16、21、22是含有CaMV35S啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)基因玉米。7、8、23、24是含有NOS終止子的抗病轉(zhuǎn)基因水稻。3、4、11、12、13、14、17、18是含有CaMV35S啟動(dòng)子和NOS終止子轉(zhuǎn)基因大豆。

                                                                                 （24個(gè)樣本的檢測(cè)結(jié)果）

反應(yīng)快速

反應(yīng)時(shí)間是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的一個(gè)重要因素，課題組觀察到在反應(yīng)時(shí)間為10 min時(shí)，就已經(jīng)能用熒光儀檢測(cè)到FAM和HEX的熒光信號(hào)。MIRA結(jié)合CRISPR反應(yīng)，也在15min后觀察到黃色熒光。

                                                                            （不同MIRA反應(yīng)時(shí)間下的熒光信號(hào)）

                                               （MIRA反應(yīng)不同時(shí)間下的試紙條顯色并用強(qiáng)度量化計(jì)算）

實(shí)驗(yàn)結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該雙重MIRA具有良好的特異性，并能準(zhǔn)確地獲得CaMV35S和NOS的擴(kuò)增產(chǎn)物，Cas13a和Cas12a系統(tǒng)獨(dú)立反應(yīng)，互不干擾。MR-DCA檢測(cè)能在35min的低溫下準(zhǔn)確檢測(cè)到20個(gè)拷貝，具有在田間檢測(cè)轉(zhuǎn)基因作物的巨大價(jià)值。

相關(guān)產(chǎn)品：

MIRA試劑盒及試紙條系列：

Cas酶系列