近日，上海交通大學生命科學技術學院張大兵團隊楊立桃課題組，在生物傳感器領域權威期刊《Biosensors and Bioelectronics》(IF: 10.618)在線發(fā)表了題為“PAM-free Loop-mediated Isothermal Amplification Coupled with CRISPR/Cas12a Cleavage (Cas-PfLAMP) for Rapid Detection of Rice Pathogens”的研究論文，首次結合核酸固相提取、LAMP等溫擴增、CRISPR/Cas12a體外剪切和免疫試紙條，建立了一種現場快速核酸檢測技術體系Cas-PfLAMP，并成功應用于田間水稻病原體（水稻白葉枯病，XOO；水稻條紋病毒病，RSV；水稻黑條矮縮病，RBSDV）快速檢測。上海交通大學生命科學技術學院博士研究生朱早兵為本文的第一作者，生命科學技術學院楊立桃教授為通訊作者。
水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的糧食作物之一。然而，水稻常見的病害，如：水稻白葉枯病（XOO）、水稻條紋病毒病（RSV）和水稻黑條矮縮?。?/span>RBSDV）等嚴重影響著水稻產量和稻米品質，尤其是在中國、韓國和日本等亞洲國家。關于水稻病原菌的預防和快速診斷研究，前人已經報道了多種檢測方法，如：生物接種法、電子顯微鏡法、熒光的免疫分析法、基于抗體的血清學診斷、熒光定量PCR法、重測序法等，然而，這些技術方法對于水稻病害預防和檢測存在一定不足，如：檢測周期長、準確性差、靈敏度低等。
近年來，基于成簇的規(guī)則間隔短回文重復序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas）系統(tǒng)被廣泛應用于基因組編輯和核酸檢測領域。CRISPR/Cas12a (Cpf1)等具有反式切割活性（trans-activity）以及向導RNA (sgRNA)的雙鏈DNA的特異性識別和切割活性的特點，為新一代快速核酸檢測技術開發(fā)打開了一扇門。如：張鋒教授團隊的夏洛克檢測系統(tǒng)SHERLOCK(Cas13)，Doudna教授團隊的DETECTR系統(tǒng)(Cas12 or Cas14)，王金/趙國屏教授團隊開發(fā)的HOLMES系統(tǒng)(Cas12)等。該研究，作者開發(fā)了一種不依賴于間隔區(qū)相鄰基序(PAM)、CRISPR/FnCas12a剪切輔助的環(huán)介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）檢測技術，Cas-PfLAMP。Cas-PfLAMP巧妙的結合了LAMP等溫擴增、FnCas12a蛋白的反式切割活性的優(yōu)點，有效提高了Cas-PfLAMP檢測的靈敏度和特異性，克服了傳統(tǒng)的LAMP檢測假陽性高的缺點。該研究以三種水稻病原體（XOO，RSV，RBSDV）為對象，設計了病原菌特異性的引物和sgRNA，系統(tǒng)評價了Cas-PfLAMP技術的特異性、靈敏度和準確性，結果表明Cas-PfLAMP能夠準確區(qū)分三種水稻病原菌，靈敏度達到了3-9個拷貝/反應。
圖1.Cas-PfLAMP工作原理示意圖
同時，研究人員還發(fā)明了一種適合于植物葉片核酸固相提取新方法，將DNA/RNA固定在葉片組織上，在5~10分鐘內可以完成96個水稻葉片樣本的核酸固相提取。研究人員將Cas-PfLAMP技術、固相核酸提取方法、側向流動試紙條(LFS)優(yōu)化組合，搭建了一套田間快速可視化檢測平臺，并成功用于田間3種水稻病原體（XOO，RSV，RBSDV）的現場檢測。從樣本采集，核酸提取，到最后結果讀出，全程檢測時長約為60分鐘。田間樣本測試結果與常規(guī)的PCR檢測結果完全吻合，證明了Cas-PfLAMP在田間快速檢測時具有準確性高、特異性好。研究結果表明，Cas-PfLAMP檢測系統(tǒng)性能優(yōu)良，不僅適用于水稻病原體的現場快速檢測，還可以進一步擴展應用于其他植物病原體、動物疫病等核酸檢測領域。該研究也為核酸分子快速、可視化檢測提供了新的思路。
圖2.Cas-PfLAMP田間快速可視化檢測平臺工作流程示意圖
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